Прогрессивные медицинские технологии тест на коронавирус

Альтернатива ПЦР-диагностике

В любом случае нужно повышать чувствительность тест-систем на основе ПЦР, заключает Алексей Чемерис, а для этого нужны другие подходы. «Надо сделать так, чтобы ложнонегативных результатов было меньше, практически исключить их», — считает он.

В обзоре, подготовленном вместе с коллегами, профессор Чемерис рассматривает преимущества и недостатки ПЦР-диагностики и других методов амплификации — копировании РНК бетакоронавирусов, к которым относится SARS-CoV-2. Теоретически весьма перспективен метод петлевой амплификации — LAMP, где используют сразу шесть или восемь праймеров.

«С одной стороны, повышается специфичность: только когда все праймеры отожгутся (сработают, распознав РНК коронавируса. — Прим. ред.), начнется амплификация, с другой — вирус мутирует и шансы, что реакция не пойдет, увеличиваются, поскольку какие бы участки генома ни выбрать, все равно вероятность мутаций больше в восьми участках, чем в двух или трех (при использовании гибридизационного зонда), достаточных для ПЦР», — объясняет исследователь.

Во время предшествующей эпидемии SARS возбудителя выявляли с помощью реакции NASBA (амплификации на основе секвенирования нуклеиновых кислот) и RCA (репликации по типу катящегося кольца). Геномный редактор CRISPR-Cas также пробуют применять для идентификации РНК нового коронавируса. Есть работы по полногеномному секвенированию любого генетического материала, находящегося в биоматериале. Метод очень чувствительный, но дорогой и долгий — занимает 20 часов. Так что в ближайшее время ПЦР с обратной транскрипцией останется самым массовым способом обнаружения коронавируса в организме.

Иммуноферментный анализ

От того, какие анализы сдают на коронавирус, нередко зависит дальнейшая терапевтическая тактика. Так, методом ПРЦ удается только определить, болен человек или нет. А с помощью иммуноферментного анализа можно установить даже тяжесть протекающего в его организме инфекционно-воспалительного процесса.

Этим методом ищут в биоматериале не коронавирусы, а вырабатываемые иммунной системой иммуноглобулины — белки, способные обнаружить и уничтожить патогенов. Существуют их более двух десятков видов, но диагностически значимыми являются M, G и A.

В зависимости от того, какие иммуноглобулины обнаружены, клиницисты судят о состоянии здоровья. Как правило, в процессе исследования устанавливается количество их всех. Но в некоторых крупных лабораториях можно сдать анализ на иммуноглобулины класса G или M. И дело не только в экономии денежных средств, но и желании только оценить качество сформировавшегося иммунитета.

Интерпретация результатов

Так как каждый класс иммуноглобулинов выявляется в крови человека на определенном этапе течения коронавирусной инфекции, то по преобладанию одного над другими удается его установить. У иммуноферментного анализа пять основных результатов:

• большое количество IgM — остро протекающий инфекционно-воспалительный процесс в организме;
• отсутствие IgM — человек или здоров, или заболевание приняло хроническую форму;

• наличие IgA при отсутствии IgM — инфекция протекает скрыто, человек является бессимптомным вирусоносителем;

• есть и IgM, и IgA — человек болен коронавирусом в острой форме;
• IgG — человек выздоровел и приобрел временный иммунитет к заболеванию.

Как и в случае ПРЦ, результаты ИФА бывают ложноположительными, например, при гормональных колебаниях во время беременности или недавней вакцинации.

Анализ не занимает много времени, но в период пандемии результата приходится подождать 1-3 дня. В качестве биоматериала используется кровь из вены.

Поэтому за день до тестирования нужно подготовиться — не употреблять алкогольные напитки, отказаться от жирных блюд и повышенных физических нагрузок. Если прием каких-либо фармпрепаратов обязателен, необходимо сообщит об этом врачу.

Информативность ИФА

Иммуноферментный анализ — лабораторная методика обнаружения антител к коронавирусам. Причем она может быть как качественной, так и количественной. В условиях пандемии специалисты лабораторий обычно определяют только наличие иммуноглобулинов, а не их численность на определенную единицу объема крови. Высокая информативность ИФА базируется на современных технологиях проведения реакции антиген-антитело.

Иммуноферментный анализ точен, но не дешев. До пандемии коронавируса он проводился только при сомнительных результатах других биохимических исследований. ИФА часто используется для подтверждения диагноза при беременности ввиду его полной безопасности. А также при выявлении скрытых патологий у лиц, желающих стать донорами.

Теперь в крупных городах любой желающий может провериться бесплатно, чтобы узнать, был ли он болен в последние месяцы коронавирусом и есть ли у него иммунитет.

Есть у ИФА и недостаток. Исследование выполняется только при подозрении на наличие конкретного заболевания, например, коронавируса. В остальных случаях тестирование покажет, что в крови человека циркулируют антитела, но определить, для уничтожения каких инфекционных возбудителей они выработались, не сможет.

Что делать при положительных антителах

Положительные антитела к коронавирусу lgM свидетельствуют о заболевании, протекающем на момент сдачи анализа. Если они обнаружены, то результаты пациента передаются в единый реестр зараженных Роспотребнадзора, что влечет за собой соблюдение 2-хнедельной самоизоляции. Иметь симптомы при этом необязательно.

Серологическое окно – это временной отрезок, в котором вирус уже проник в кровь и начал размножаться, но антитела еще не появились

Итак, «период окна», серонегативное, сероконверсионное окно — это период времени, когда инфекционный агент (вирус, бактерия и др.) уже попал в организм и размножается, но антитела в крови больного еще не появились.

При lgM≥1.0 человек является носителем вируса и представляет опасность для окружающих. В данной ситуации действуют следующие правила:

• на связь выходит сотрудник оперштаба и сообщает о результатах анализа. Он же рассказывает о необходимости самоизоляции и визите доктора, который состоится в ближайшие дни. Врач будет и дальше контролировать состояние больного;
• посещение врача включает доставку лекарств, назначение мазка ПЦР и выписка больничного листа при необходимости;
• приходит СМС с кодом активации сервиса телемедицины, чтобы можно было связаться с медиками в любое время;
• периодически пациенту звонят и спрашивают о самочувствии;
• когда срок самоизоляции заканчивается, мазок берут еще раз. При отрицательном результате все ограничения снимаются.

В экстренных ситуациях – например, при некорректной работе медицинских сотрудников – можно звонить на горячую линию по телефону +7-499-251-83-00.

Дополнительная информация: Если антитела lgM найдены, но симптомов нет, то заболевание может быть бессимптомным или проявиться чуть позже.

Союзники и посредники

Многие частные компании не разрабатывают свои тесты, но предлагают оборудование для их масштабного производства. В «Инвитро», обладающей необходимыми клинико-диагностическими лабораториями для выполнения анализов, заявили, что ведут переговоры с несколькими производителями. Однако запускать производство и продажу тест-систем там намерены строго после получения разработчиками регистрационного удостоверения.

— Мы рассчитываем, что это произойдет уже в мае, — сообщила руководитель отдела по связям с общественностью «Инвитро» Нина Орешкина. — Рассматриваем тест-системы как отечественных, так и международных производителей. Сейчас ведем переговоры по возможным срокам их поставки.

Тест-2

Фото: ИЗВЕСТИЯ/Кристина Кормилицына

Другие коммерческие компании уже предлагают неофициальные услуги по тестированию — продают зарубежные тесты, в частности, китайские, голландские и немецкие. Однако обыватель пока не может ими воспользоваться. По словам источника «Известий», такие тесты были опробованы в исследовательских целях только в ряде российских госпиталей, в том числе в Коммунарке.

Впрочем, существует биотехнологический стартап ANTICOV, на сайте которого в данный момент любой желающий может бесплатно оставить предзаказ теста. Продажи планируют начать в середине мая, цена за один анализ составит 4,3 тыс. рублей.

В ANTICOV «Известиям» сообщили, что у них есть несколько вариантов сотрудничества с производителями тестов, которые сейчас прорабатываются. Отечественные это или зарубежные тесты, там не уточнили. Но основным партнером стартапа на данный момент является Центр Genetiсo.

Тест на нейтрализующие антитела к рецептор-связывающему домену (RBD) белка S

Для чего нужен: Определение силы иммунитета к коронавирусной инфекции, в будущем – оценка эффективности вакцины.

Кто должен сдавать:

• Те, кто переболел коронавирусной инфекцией ив крови обнаружены антитела IgG
• Те, кто хотят узнать статус своего иммунитета к коронавирусной инфекции

Когда делать: качественный (RBD) анализ антител может проводиться с момента появления IgG в крови – с 3-4 недели с момента контакта с вирусом SARS-CoV-2.

Комментарий: Инфицирование вирусом происходит благодаря способности его мембраны соединяться с клетками организма человека. За это отвечает так называемый рецептор-связывающий домен (RBD) одного из его белков (S). Маркером перенесенной инфекции и наличия иммунитета к ней является наличие IgG к вирусу в крови. Однако количественный анализ на антитела IgG не отвечает в полной мере на вопрос, насколько сильно защищен организм.

О силе иммунитета позволяет судить качественный анализ – тест на нейтрализующие антитела к рецептор-связывающему домену (RBD) белка S коронавируса. Именно такие антитела обладают нейтрализующими свойствами и препятствуют связыванию вируса с клетками человека, тем самым обеспечивая важную роль в определении индивидуального иммунного ответак вирусу SARS-CoV-2. В случае обнаружения RBD-антител в крови, можно сделать вывод о том, что в настоящее время иммунная система организма обеспечивает защиту от коронавирусной инфекции.

В поиске иммунитета

Тестирование на антитела к SARS-CoV-2, по сообщению Роспотребнадзора, стартовало в России во вторник, 14 апреля. Однако пока оно доступно лишь медперсоналу. Анализы берут в десяти клиниках Москвы, которые работают с инфицированными новым коронавирусом. А сам тест проводит Московский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского. Новый диагностический инструмент позволяет выявлять переболевших, а также изучать популяционный иммунитет и проводить оценку эффективности разрабатываемых вакцин против коронавирусной инфекции.

Тест-3

Фото: ИЗВЕСТИЯ/Дмитрий Коротаев

Диагностический набор разработан в государственном научном центре «Вектор» (Новосибирск). К данному моменту лишь он зарегистрировал свою тест-систему под названием «SARS-CoV-2-ИФА-Вектор» для определения антител к новому коронавирусу. Регистрация была получена 10 апреля 2020 года, — сообщили «Известиям» в Роспотребнадзоре. Созданная в кратчайшие сроки тестовая система прошла все необходимые технические и клинические испытания. Регистрационное удостоверение выдано в установленном законом порядке и является бессрочным. Но для широкого использования этот анализ пока не доступен. В первую очередь планируют проверять на наличие антител медицинских работников, чтобы иметь четкое представление о приобретенном иммунитете врачей для сохранения кадрового состава в инфекционных больницах.

Сам тест представляет собой иммуноферментный анализ (ИФА) сыворотки плазмы крови человека. На подложку теста исследователи помещают каплю этой сыворотки. Антитела из нее связываются с нанесенными на ту же подложку белками SARS-CoV-2. Чтобы тест визуально реагировал на антитела, добавляют особый реагент, который меняет цвет в ответ на их присутствие в пробе. Интенсивность цвета зависит от концентрации антител в сыворотке.

Маркеры инфекции – lgG и lgM

Тестирование на антитела проводится одним из 2-х методов: ИФА (иммуноферментным) или ИХЛА (иммунохемилюминесцентным). Референсные – нормальные – значения:

• lgG=10.0, в некоторых тест-системах – 2.5;
• lgM=2.0.

Данные цифры обозначают коэффициент позитивности.

Основной целью выявления антител в крови является оценка формирования коллективного – популяционного – иммунитета. В зависимости от того, у скольких людей они обнаружатся, будут сниматься или ужесточаться ограничительные меры. Чем больший процент получится в итоге, тем ближе окончание пандемии.

Кроме того, по результатам анализа можно понять, встречался ли человек с вирусом, болеет ли в настоящий момент или уже перенес инфекцию. То есть тест весьма информативный, особенно в сочетании с данными мазка ПЦР, взятого из носоглотки.

Применительно к Sars-CoV-2 определяются 2 вида специфических иммуноглобулинов – lgG и lgM. lgM – это быстрые антитела, которые еще называют «тревожными» из-за их появления почти сразу после попадания чужеродного агента в организм.

lgM

Глобулины класса М вырабатываются с первых дней заражения и присутствуют в крови приблизительно на 3-5 сутки. Они представляют собой первую линию защиты и остаются в кровотоке от недели до месяца.

Результат считается положительным при lgM>1 ЕД/мл.

lgG

Антитела Джи приходят на смену глобулинам m и сохраняются дольше. Именно они обеспечивают формирование стойкого иммунитета к Covid-19 и препятствуют повторному инфицированию.

Синтез lgG стартует спустя 2-3 недели после заражения. Их уровень считается положительным при 10 ЕД/мл и выше.

lgA

Это тоже ранние антитела, которые продуцируются почти в одно время с lgM, но являются более специфичными. Анализ на их содержание рекомендуется делать при подозрении на текущее или недавно перенесенное заболевание. Для максимальной точности результатов лучше сдать комплексный тест на lgA и lgM.

Антитела А служат барьерной защитой, находясь в зоне «входных ворот» инфекции – на слизистых дыхательных путей. Их задача состоит в соединении между собой чужеродных молекул, чтобы они не смогли прикрепиться к поверхности тканей.

Положительный lgA>1.1, что может означать текущее заболевание даже при отсутствии симптомов, или недавно перенесенную инфекцию, если lgG>1.1.

Дополнительная информация: Тест может давать ошибочный результат, если сделать его слишком рано, когда антитела lgA и lgM еще не начали вырабатываться.

Стоит отметить, что наиболее часто в диагностике коронавируса используются анализы на lgM и lgG. Сдать их можно в платной клинике – Инвитро, Гемотесте, Медси пр.

Что происходит со взятыми образцами?

Thilo Schmuelgen/REUTERS

Медицинская лаборатория в Кёльне, Германия

Взятый у пациентов материал направляется в лаборатории центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, расположенные в российских регионах. Туда же будет отправлять положительные и сомнительные образцы «Гемотест».

Для постановки диагноза однократной сдачи биоматериала Анализ у пациентов без симптомов ОРВИ берется дважды. У тех, у кого симптомы ОРВИ присутствуют, биоматериал берется при первичном обращении или поступлении в стационар, а потом спустя три и семь дней. Такой подход позволяет снизить вероятность получения как ложноположительного, так и ложноотрицательного результата.

В случае получения положительного или сомнительного результата биоматериал направляют в расположенный в Новосибирске Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор». Он Европейским бюро Всемирной организации здравоохранения в список из шести референс-лабораторий по коронавирусу. Кроме России такие референс-лаборатории находятся в Нидерландах, Германии, Великобритании и Франции. В них подозрительные образцы направляют и из тех европейских стран, где референс-лаборатории отсутствуют.

Биоматериал «подозрительных» пациентов в Новосибирск поездом: пробы помещают в герметичные пробирки, несколько герметично запаянных пластиковых пакетов, металлический и транспортировочный контейнеры с охлаждающими элементами

Все эти меры предосторожности необходимы для предотвращения повреждения контейнеров с пробами и распространения вируса

Клиентам частных лабораторий, в том числе «Гемотеста», после получения положительного или сомнительного результата самостоятельно позвонить на горячую линию Роспотребназдора.