Пцр на ковид не обнаружено

Достоинства и недостатки метода ПЦР

Современные методы позволяют точно подобрать набор веществ, нужных для реакции, а значит, «достроить» именно ДНК SARS-Cov-2, а не другого похожего.

Теперь о недостатках. Первое — относительно высокая цена. Она обусловлена высокой себестоимостью как праймеров, так и оборудования – амплификаторов. Второе — время. Ждать, пока размножится ДНК, нужно несколько часов, а с учетом транспортировки до лаборатории результаты теста пациент может узнать через сутки и более.

Также эффективность теста не превышает 80%. Праймеры для реакции подбираются на основе информации об РНК вируса. Но фрагмент с теми же «буквами» может оказаться и в других микроорганизмах пробы – отсюда ложноположительный результат. Ложноотрицательный результат получится, если вирусные частицы ушли из ротоглотки, спустились дальше по дыхательному пути. Тогда в пробе просто не окажется РНК вируса.

Сдавать тест ПЦР есть смысл в том случае, если человек контактировал с пациентом с подтвержденным коронавирусом.

В каких случаях проводится исследование – Covid – 91 RT-PCR

Тест может быть назначен при наличии симптомов, свидетельствующих о заражении SARS-CoV-19, особенно если пациент контактировал с человеком с COVID-19 и / или подвергался повышенному риску заражения. 

Инфекцию можно заподозрить по следующим симптомам:

• высокая температура;
• кашель;
• одышка;
• симптомы гриппа (слабость, иногда с повторным ознобом);
• мышечные боли;
• головная боль;
• больное горло;
• внезапная потеря вкуса или запаха.

Центры по профилактике и контролю заболеваний разработали руководящие принципы о необходимости тестирования, но окончательное решение относительно тестирования принимается лечащим врачом и национальными и местными органами здравоохранения.

Анализ нужен не в каждом случае. Большинство инфицированных людей имеют симптомы легкой и средней тяжести и могут лечиться дома независимо от результата теста. В этой ситуации лечиться дома может быть безопаснее, чем посещать медицинские учреждения – как для пациентов, так и для медицинских работников. 

Кроме того, никакая специальная терапия для этого вируса еще не была одобрена, поэтому результаты теста не повлияют на лечение. Однако результаты теста могут быть полезны при принятии решения, например, оставаться ли в изоляции и информировать ли людей, с которыми был тесный контакт.

По мере развития текущей ситуации тесты ОТ-ПЦР могут проводиться во все большем масштабе, например, по тем или иным причинам, поступающим в больницу. Результаты могут помочь определить, должны ли такие пациенты быть изолированы во время госпитализации. 

Тесты также можно использовать для определения инфекции у контактировавших с зараженным человеком, а также для проверки сотрудников на предмет выявления активных инфекций.

Что известно о мутировавшем коронавирусе в Британии:

•  новый вирус более заразен и распространяется быстрее обнаруженных ранее штаммов.
•  устойчив ли новый штамм к вакцине — точных данных пока нет, но предполагается, что неусточив.
• является ли новый штамм смертельнее — точных данных пока нет, но считается, что не является.
•  новый штамм обнаружен кроме Британии в ЮАР, Австралии, Нидерландах, Дании и Италии.

Что говорят британские и американские медики о прививках
Медицинские эксперты пытались заверить общественность в том, что новый штамм не повлияет на кампанию по вакцинации, которая началась в Великобритании и США в этом месяце.
Одна из причин заключается в том, что вирус должен существенно измениться, чтобы «избежать» нынешней вакцины. Даже если это так, вакцины можно отрегулировать, чтобы не отставать от изменяющих форму патогенов, как в случае с ежегодной прививкой от гриппа.

Главный хирург США Джером Адамс заявил на канале CBS News, что «нет никаких признаков», что новый вариант коронавируса помешает усилиям США по вакцинации.

Экс-глава Роспотребнадзора, академик РАН Геннадий Онищенко:
«Пока данных, что он прорывает действующий иммунитет, нет. Это не первая такая мутация — первая была еще в марте в Китае, когда он стал более контагиозным, мутаций у этого коронавируса было уже несколько сотен», — сказал Онищенко «Интерфаксу».

Роспотребнадзор о новом штамме COVID-19 в Британии:
«Мутации ожидаемы для вирусов, редко влияют на вирусную приспособленность».

Врач и телеведущий Александр Мясников заявил, что бояться нового вида коронавируса, обнаруженного в Великобритании, не стоит.

При этом он отметил, что зараза будет распространяться быстрее своей предыдущей версии, но сила его при этом сократится. Мясников полагает, что вирус уже вырвался за пределы Великобритании, поэтому закрывать ее границы бессмысленно.

Вирусолог, бывший заведующий лабораторией центра «Вектор» Александр Чепурнов:
«У нас он появится, потому что нет барьеров. У нас много людей, которые граждане и Великобритании, и России, у нас много людей, которые будут ездить и ездят туда-обратно. И они наверняка уже его привезли. Ему нужно какое-то время, чтобы накопиться, а потом он рванёт. Значит, будет больше заболевших, больше нагрузки на медиков.
Любой биологический объект, который имеет то или иное преимущество – может, например, размножаться быстрее или обладает большей летучестью, – всегда имеет преимущество и всегда будет замещать исходный штамм. Это обязательное биологическое свойство, и от него никуда не денешься», — рассказал Чепурнов RT.

Профессор Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени Гамалеи Александр Бутенко о британском коронавирусе:

«Наверное, что-то серьёзное, нужно насторожиться, держать руку на пульсе. Как показала весенняя практика, прекращение или резкое сокращение авиасообщения наряду с другими мерами приводит к хорошему эффекту.  Мутация может достичь такой степени, что уже разработанные вакцины могут не помогать. Ещё точно не известно, насколько широкое распространение получит новый штамм и какова будет тяжесть заболевания», — сообщил Бутенко телеграм-каналу «Подъем».

Руководитель отдела экспериментального моделирования и патогенеза инфекционных заболеваний ФИЦ ФТМ Александр Шестопалов.

«Вирус мутирует всегда, с высокой скоростью. Сейчас выявлен вариант британский, до этого выявлялся датский — однако в целом летальность вызванного им заболевания не меняется, оставаясь в границах 1-3% в зависимости от того, кто как считает», — сообщил он «Интерфаксу».
По его мнению, преждевременно говорить о том, что новый вариант вируса может стать доминирующим, однако изучение SARS-CoV-2 должно продолжаться.

Британские СМИ пишут, что если новый штамм способен «уклоняться» от обычного иммунного ответа, это также может объяснить, почему он распространяется быстрее, поскольку он может затронуть и тех, кто уже переболел коронавирусом.

По данным британских научных отчетов, четверо из примерно 1000 человек, инфицированных новым вариантом коронавируса, ранее были заражены COVID-19.
Идея о том, что вирус Covid-19 может развиться достаточно, чтобы снова заразить людей, несмотря на иммунитет к исходному микробу, не будет полной неожиданностью, говорят медики. Известно, что другие коронавирусы, вызывающие простуду, часто повторно заражают людей.

Метод ПЦР

ПЦР — это метод полимеразной цепной реакции. О нем наслышаны многие, хотя до эпидемии значение аббревиатуры ПЦР было знакомо лишь криминалистам, генетикам, а также лабораторным работникам, определяющим ВИЧ, сифилис, гепатиты, туберкулез и еще ряд заболеваний.

Как работает ПЦР и какие бывают вирусы

ДНК — это двойная спираль, кодирующая генетическую информацию, в том числе, вирусов. Обе части ДНК соединены по принципу комплементарности. То есть, один элемент может соединяться только с соответствующим ему. Например, гуанин (G) только с цитозином(C). ДНК-содержащие вирусы — это вирус герпеса, оспы, гепатита В. Коронавирус относится к РНК-содержащим вирусам.

Для исследования методом ПЦР берется мазок из ротоглотки. Если в материал для анализа попала вирусная частица, то в лаборатории одна нить ее РНК достраивается до двойной спирали ДНК.

РИА Новости/Сергей Пивоваров

В чем суть метода ПЦР?

Вместо того, чтобы искать иголку в стоге сена (одну нить вирусной частицы), можно сделать целый «клубок» нитей, найти которые не составит труда. Нуклеотидная последовательность («буквы») РНК вируса уже расшифрована. И к этим «буквам» по принципу комплиментарности присоединяются в результате химической реакции другие. В итоге получается молекула ДНК. Она служит матрицей. Затем ее многократно размножают примерно по той же технологии. ДНК помещают в раствор со специальным набором химических веществ в устройство-амплификатор, в котором периодически меняется температура от 50 до 92 градусов. В нем, как в ксероксе, ДНК копируется.

Финальный этап исследования – электрофорез, на нем можно увидеть размноженные копии ДНК. ДНК заряжена отрицательно, и в электрическом поле ее притягивает положительный заряд. Притягиваясь к нему, размноженная ДНК проходит через краситель. Чем больше фрагмент ДНК, тем медленнее он двигается и тем ярче окрашивается.

Если в биоматериале пациента не было вирусной частицы, то и первая цепочка ДНК не выстроится – химическим веществам, подобранным для строительства, не за что будет «зацепиться». Соответственно, форез ничего не покажет.

Тест на антитела (серологический)

• Положительный тест на антитела указывает на перенесенную ранее инфекцию SARS-CoV-2. Это может означать, что пациент устойчив к вирусу и больше не будет заражен. Однако SARS-CoV-2 является новым патогеном, и до сих пор неясно, обеспечивает ли предыдущая инфекция иммунитет, и если да, то как долго.
• Отрицательный результат теста означает, что иммунная система не продуцировала антитела против инфекции, то есть испытуемый не имел инфекции SARS-CoV-2. Однако результат также может быть отрицательным, если тест был проведен слишком рано после заражения, когда количество антител в организме еще не обнаружено. 

Согласно CDC, уровень антител может быть определен в течение 1-2 недель после того, как пациент заболел, хотя в некоторых случаях для выработки антител может потребоваться больше времени.

Мазки на коронавирус

Точность ПЦР тестов

Проблема ОТ-ПЦР в реальном времени ― риск получения ложноотрицательных и ложноположительных результатов. Многие «подозреваемые» случаи с типичными клиническими характеристиками COVID-19 и идентичными специфическими изображениями компьютерной томографии (КТ) не были диагностированы ПЦР тестированием. Т.е. отрицательный результат не исключает заражения COVID-19 и не должен использоваться в качестве единственного критерия для принятия решений о лечении или ведении пациента. В то же время, при отрицательном результате, стоит о задуматься о возможности заражения каким-либо другим вирусом.

Ложноотрицательные результаты могут быть получены из-за мутаций в геноме SARS-CoV-2. Попытка разработать анализ ОТ-ПЦР в реальном времени как можно точнее, может привести к снижению эффективности анализа и потенциальному ложным отрицательном результатам. Несколько типов наборов для ОТ-ПЦР в реальном времени SARS-CoV-2 были разработаны и быстро одобрены, но с разным качеством.

Чувствительность и специфичность самого качественного теста ОТ-ПЦР в реальном времени не составляет 100%.

Ложноположительным результатам сильно способствует процедура отбора проб. Наиболее точным образцом для лабораторной диагностики COVID-19 является мокрота, за ней следуют мазки из носа. Мазки из зева не рекомендуются для диагностики.

Отбор проб для ПЦР

Сбор образцов, таких как мокрота, мазок из носа и мазок из горла, является быстрым, простым и безопасным. Образцы должны быть получены с помощью тампонов из дакрона или полиэстера и должны быть как можно быстрее доставлены в лабораторию. На получение результатов нужно от 24 до 48 часов.

Точность результатов ПЦР-теста на коронавирус очень сильно зависит от соблюдения процедуры отбора проб, скорости доставки проб в лабораторию и качества реактивов.

В случае отрицательного результата ПЦР, но с подозрением на клинические признаки COVID-19 используют несколько типов образцов в разные моменты времени. Сочетание ОТ-ПЦР, клинических характеристик и изображения КТ облегчает диагностику и лечение заболевания.

Всегда ли ошибаются тесты

Следует понимать, что сомнительный тест далеко не всегда бывает ошибочным. Вполне возможно, что результаты повторных обследований будут идентичными. Но в любом случае медики, сотрудники лабораторий пытаются разобраться, почему первые данные вызвали сомнения. Одна из причин — малоизученность коронавирусной инфекции. Структура ее возбудителя необычна, объясняет легкость проникновения в дыхательные пути, ускоренную репликацию, быстрое распространение по дыхательной системе.

Это интересно: У коронавирусов на поверхности есть шипы, с помощью которых они «обманывают» клеточные рецепторы и проникают внутрь, начиная размножаться.

Пока еще окончательно не изучен механизм развития инфекции. Это означает, что тесты будут постепенно совершенствоваться, а их чувствительность — повышаться. Самостоятельно определить информативность лабораторной диагностики невозможно. Это прерогатива врача. Он сопоставляет полученные данные с клинической картиной, эффективностью проводимого лечения, наличием инфицированных родственников.

Первый этап

Инкубационный период коронавирусной инфекции — время с момента внедрения патогенов в организм до появления выраженных симптомов. Длится он у взрослого человека с хорошим состоянием здоровья — от одной до двух недель. Его продолжительность составляет от 1 до 3 дней при наличии хронических заболеваний, а также у зараженных людей пожилого и старческого возраста. В медицинской литературе описаны случаи позднего появления симптомов на фоне приема иммуномодуляторов и противовирусных лекарств.

Тест ИФА на коронавирус вызывает сомнения, если он выполнен во время инкубационного периода

Пока признаков опасной патологии нет, врачи не рекомендуют выполнять тестирование, так как его результат может быть сомнительным. С коронавирусами борются интерфероны, часто с большим успехом. Если ими были уничтожены патогены, то антитела иммунной системой не вырабатывались. Так что, результат тестирования будет сомнительным.

Второй этап

Может ли быть сомнительным тест на второй стадии развития инфекции? Это реально при обследовании методом и иммуноферментного анализа, и ПЦР. Первые симптомы проявились, поэтому человек самостоятельно или по назначению врача принимает противовирусные средства, оставляя иммунную систему без работы. Антитела начнут вырабатываться только на заключительном этапе второй стадии.

Третий этап

Почему даже при выраженных признаках болезни ошибаются тесты? На третьей стадии коронавирусов в организме немного. Они покинули его по большей части, но оставили после себя мощный инфекционно-воспалительный процесс в бронхолегочной системе. Медики используют выражение «цитокиновый шторм». Вырабатывается огромное количество медиаторов воспаления, что приводит к повреждению собственных тканей организма. Это может исказить результаты лабораторного тестирования.

НЕ СОБЛЮДЕНЫ ПОСТУЛАТЫ КОХА

Кроме того, нет научных доказательств того, что эти последовательности РНК являются возбудителем того, что называется COVID-19.

Чтобы установить причинную связь, так или иначе, то есть помимо выделения и очистки вируса, было бы абсолютно необходимо провести эксперимент, который удовлетворял бы четырем постулатам Коха. 

1. Микроорганизм/вирус постоянно встречается в организме больных людей (или животных) и отсутствует у здоровых.
2. Микроорганизм/вирус должен быть изолирован от больного человека (или животного) и его штамм должен быть выращен в чистой культуре.Чтобы только выделить его каждый раз нужны огромные средства.
3. При заражении чистой культурой микроорганизма/вируса здоровый человек (или животное) заболевает. Кто это делал: заражал людей, да никто, это невозможно. А животные не дадут четкой картины.
4. Микроорганизм/вирус должен быть повторно изолирован от экспериментально заражённого человека (или животного).

Но такого эксперимента нет и не было, как недавно рассказали Эмори Деверо и Розмари Фрей.

Одним из примеров является исследование, опубликованное в журнале Nature 7 мая . Это испытание, помимо других процедур, делающих исследование недействительным, не соответствовало ни одному из постулатов.

Например, у предполагаемых «инфицированных» лабораторных мышей не было выявлено каких-либо значимых клинических симптомов, явно связанных с пневмонией, которая, согласно третьему постулату, должна действительно возникнуть, если там действительно бы действовал опасный и потенциально смертельный вирус. А легкая взерошенность и потеря веса, которые временно наблюдались у животных, незначительны не только потому, что они могли быть вызваны самой процедурой укола неизвестным организму веществом, но также итот факт. что вес снова вернулся к норме.

Показательно, что ни один из ведущих немецких представителей официальной теории SARS-Cov-2 / COVID-19: — Институт Роберта Коха (RKI), Александр С. Кекуле (Университет Галле), Хартмут Хенгель и Ральф Бартеншлагер (Немецкое общество) по вирусологии), вышеупомянутые Томас Лёшер, Ульрих Дирнагл (Шарите Берлин) или Георг Борнкамм (вирусолог и почетный профессор Гельмгольц-центра Мюнхена) — могли бы ответить на следующий вопрос, который им отправили:

Если частицы, которые, как утверждается, принадлежат к SARS-CoV-2, не были очищены, как вы хотите быть в этом уверены, что последовательности генов РНК этих частиц принадлежат конкретному новому вирусу?

В частности, если есть исследования, показывающие, что вещества, такие как антибиотики, которые добавляются в пробирки в экспериментах in vitro, проводимых для обнаружения вирусов, могут «подвергать стрессу» культуру клеток таким образом, что образуются новые последовательности генов, которые ранее не были обнаружены — как аспект, на который лауреат Нобелевской премии Барбара МакКлинток уже обращала внимание в своей Нобелевской лекции еще в 1983 году . Но мы не получили ответов до 18 июня 2020 года, после нескольких месяцев отсутствия ответа. В конце концов, мы добились этого только с помощью берлинского юриста Вивиан Фишер

Но мы не получили ответов до 18 июня 2020 года, после нескольких месяцев отсутствия ответа. В конце концов, мы добились этого только с помощью берлинского юриста Вивиан Фишер.

Шарите признает, что они не использовали очищенные частицы.

Вирусологи из клиники Шарите заявляют:

Это означает, что они просто предположили, что РНК была вирусной .

Между прочим, Corman et al. Документ, опубликованный 23 января 2020 года, даже не прошел надлежащего процесса рецензирования, и описанные в нем процедуры не сопровождались контролем — хотя только благодаря этим двум вещам научная работа становится действительно научной.

Принять решение

Далеко не всегда есть необходимость ориентироваться на ПЦР-тесты. Гораздо важнее оценка клинической картины, сообщил «Известиям» профессор-исследователь Балтийского федерального университета имени Канта Андрей Продеус.

— Глобально эта статья важна в том, что впервые для России это было доказано клинически на большой выборке пациентов. Нужно понимать: если тест позитивен, это говорит о наличии патогена, но если он негативен, это не означает, что вируса в организме нет. Поэтому ориентироваться на клинические признаки, такие как одышка, температура и кашель, важнее, — пояснил он.

Неопознанный COVID

Фото: РИА Новости/Антон Вергун

Более того, во время пандемии вклад других заболеваний, вызывающих вирусную пневмонию и дающих картину «матового стекла» на КТ, весьма ограничен, сообщил в разговоре с «Известиями» директор научно-клинического центра прецизионной и регенеративной медицины Казанского федерального университета (вуза — участника проекта «5-100») Альберт Ризванов.

— Логично предположить, что большинство пациентов, независимо от результатов тестирования, но демонстрирующих типичную клиническую картину, страдают именно COVID-19. Поэтому результаты исследования вполне логичны, — подчеркнул специалист

— Безусловно, важно, что в России проводятся такие качественные широкомасштабные исследования, которые в целом очень полезны как для наших врачей, так и для зарубежных коллег

Ранее главный внештатный пульмонолог Минздрава России Сергей Авдеев заявил СМИ, что примерно в 30–40% случаев тест на коронавирус может дать ложноотрицательный результат. По его словам, это не связано с качеством самих тестов. Он подчеркнул, что чувствительность и специфичность тест-систем не подвергается никакому сомнению, а проблема заключается в некачественном взятии биоматериалов.

Неопознанный COVID

Фото: ТАСС/Артем Геодакян

Что же касается новых полученных клинических данных, «Известия» направили запрос в Минздрав РФ с вопросом о том, будут ли они как-то приняты во внимание, однако получить ответ на момент публикации не удалось. В Роспотребнадзоре редакции сообщили, что причины ошибок тестов могут быть разные: наличие «похожего» по структуре, родственного возбудителя, слишком малое его количество и так далее

— Нарушения при подготовке пациента чаще всего приводят к ложноотрицательным результатам. Например, при взятии мазка на коронавирус пациент должен не менее трех часов ничего не есть и не пить, не полоскать горло. При несоблюдении этих правил можно просто «смыть» вирус и результат будет отрицательным, — сообщили в ведомстве. — Нарушение технологии выполнения анализа встречается сейчас очень редко, чаще всего это «человеческий фактор»: случайно перепутали пробу, отвлеклись и ввели результат не в ту ячейку и т.д. Во всех лабораториях ведется специальный внутрилабораторный контроль качества, который позволяет выловить такие ошибки до выдачи результата.

В исследовании Сеченовского университета сказано, что полученные результаты аналогичны данным по США, где от 42 до 51,8% людей получают ложноотрицательный результат теста ПЦР

В целом же уровень таких результатов колеблется от 20 до 66% — в зависимости от давности появления симптомов, поэтому результаты должны быть интерпретированы с осторожностью

Неопознанный COVID

Фото: ТАСС/Антон Новодережкин

Помимо российских ученых, в исследовании приняли участие сотрудники Имперского колледжа Лондона, Пизанского университета, Университета Отто фон Герике в Магдебурге и Оксфордского университета.

Анализы на COVID-19

Обычно первые симптомы COVID-19 не отличаются от обычной простуды или инфекции верхних дыхательных путей, поэтому для определения текущей или прошлой болезни необходимы тесты.

• Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Большинство тестов на наличие активной инфекции SARS-CoV-2 основаны на методе ОТ-ПЦР, который позволяет обнаруживать вирусную РНК в образце, взятом из дыхательной системы пациента. ПЦР – это лабораторный метод, используемый для получения нескольких копий коротких фрагментов ДНК из очень маленького образца ДНК, чтобы их можно было обнаружить. Этот процесс называется амплификацией. Этап обратной транскрипции позволяет вирусной РНК превращаться в ДНК, чтобы затем можно было использовать метод ПЦР.
• Анализ крови на антитела (общий, IgG, IgM) против SARS-CoV-2 (серологический тест). Обнаружено присутствие антител, продуцируемых иммунной системой организма в ответ на SARS-CoV-2. Серологические тесты на COVID-19 позволяют подтвердить предыдущую инфекцию, однако тест на антитела не является предпочтительным методом выявления активной инфекции. Антитела появляются не раньше, чем через 1-2 недели после заражения, поэтому их нельзя обнаружить на ранних стадиях заболевания. 

Также были разработаны экспресс-тесты на наличие антител. Тестируется кровь из пальца.