Неопознанный covid: больше половины пцр-тестов оказались ошибочными

Достоинства и недостатки метода ПЦР

Современные методы позволяют точно подобрать набор веществ, нужных для реакции, а значит, «достроить» именно ДНК SARS-Cov-2, а не другого похожего.

Теперь о недостатках. Первое — относительно высокая цена. Она обусловлена высокой себестоимостью как праймеров, так и оборудования – амплификаторов. Второе — время. Ждать, пока размножится ДНК, нужно несколько часов, а с учетом транспортировки до лаборатории результаты теста пациент может узнать через сутки и более.

Также эффективность теста не превышает 80%. Праймеры для реакции подбираются на основе информации об РНК вируса. Но фрагмент с теми же «буквами» может оказаться и в других микроорганизмах пробы – отсюда ложноположительный результат. Ложноотрицательный результат получится, если вирусные частицы ушли из ротоглотки, спустились дальше по дыхательному пути. Тогда в пробе просто не окажется РНК вируса.

Сдавать тест ПЦР есть смысл в том случае, если человек контактировал с пациентом с подтвержденным коронавирусом.

Особенности ПЦР-исследования

Метод полимеразной цепной реакции, как расшифровывается ПЦР, обладает высокой чувствительностью и определяет в образцах пациента любые типы инфекций – грибы, вирусы, бактерии.

Для лабораторного исследования можно брать любую биологическую жидкость, где могут обнаруживаться чужеродные микроорганизмы: слюну, мочу, кровь. Однако чаще всего производится забор промывных вод бронхов и мазка из носоглотки, причем последняя процедура проще.

Взятые пробы обрабатываются специальным реагентом для выделения фрагментов вирусного РНК. Затем эти фрагменты многократно увеличиваются с помощью фермента полимеразы и воздействия низкочастотных токов. В итоге чужеродные молекулы становятся видимыми для тест-систем.

Благодаря высокой чувствительности методика ПЦР обеспечивает достаточно точные результаты даже при малых концентрациях вирионов – вирусных частиц – в образцах и отсутствии клинических симптомов заболевания.

ПЦР-тестирование – это качественный метод, дающий однозначный ответ на вопрос: болен человек или здоров. С его помощью нельзя определить, насколько давно произошло заражение, сколько вируса в организме, и на какой стадии находится болезнь. Для этого есть другие способы диагностики – в частности, анализы на антитела.

Чем уникален ПЦР-тест

Коронавирус Sars-CoV-2, как и другие респираторные инфекции, попадает в человеческий организм через слизистые глаз, носовой и ротовой полости. Он прикрепляется к мембранным рецепторам клеток посредством вирусных шипов, и наиболее уязвимыми являются дыхательные пути, мочевыделительные и пищеварительные органы. На их внутренних поверхностях имеются ферменты АПФ2 и АСЕ2, с которыми и связываются вредоносные частицы.

В первые дни после проникновения коронавирус активно клонируется в эпителии, выстилающем носоглотку, поэтому обнаруживается в слюне и муконазальном секрете. Вирусоносители, сами не зная о том, распространяют инфекцию при кашле, чихании, смехе и разговоре. Причем даже при отсутствии симптомов они могут заражать окружающих.

Если пришлось контактировать с ковидным больным, рекомендуется как можно скорее промыть нос, рот и глаза хотя бы водой

Определить, что человек болеет именно Covid-19, может только ПЦР-тест, поскольку симптомы, особенно на ранних стадиях, практически не отличаются от простуды.

В крови и лимфатической жидкости коронавирус не циркулирует, поэтому материал для исследования берут из носоглотки. Точность анализа не превышает 80%, и вероятность получения неверных результатов достаточно велика.

Кроме того, на слизистых вирус долго не держится, подвергаясь атакам иммунных клеток и смываясь слюной. Следовательно, целесообразно повторять анализ несколько раз, особенно при наличии явных симптомов, а также дополнять его тестом на антитела.

Серологический анализ на COVID-19

Несмотря на множество разработанных тестов на антитела, на сегодняшний день серологическая диагностика имеет ограничения как по специфичности, так и по чувствительности. Опять же, результаты разных тестов различаются. 

Исследования CDC по тесту, разработанному Центром исследования вакцин США при Национальном институте здоровья, продолжаются. Следует отметить, что этот тест имеет специфичность выше 99% при чувствительности 96%.

Исследования дают нам много данных о роли серологии. Например, было показано, что перекрестной реактивности между аутоантителами, собранными из образцов сыворотки пациентов с аутоиммунным заболеванием, и антителами против SARS-CoV-2, нет. Тем не менее необходимы дальнейшие исследования для выяснения некоторых аспектов этого вопроса

Особенно важно выяснить:

• Обеспечат ли антитела IgG иммунитет от будущей инфекции SARS-CoV-2.
• Защитный титр антител.
• Продолжительность защиты.

В любом случае серологические исследования могут играть важную роль в широкомасштабном эпиднадзоре.

Что делать, если вирусный тест положительный?

Если получен положительный результат, должны быть приняты следующие профилактические меры:

• Оставайтесь дома, если вам не нужна медицинская помощь.
• Оставайтесь на связи с врачом и следите за симптомами. Если симптомы ухудшаются, обратитесь к врачу.
• В случае проблем с дыханием или при наличии других серьезных симптомов, немедленно обратитесь за медицинской помощью.
• Избегайте контакта с другими членами семьи. Если возможно, используйте отдельную ванную комнату.
• При кашле или чихании прикрывайте рот и нос платком или локтем. Часто и тщательно мойте руки с мылом и водой.
• Часто чистите и дезинфицируйте помещения и поверхности дома. Помещения, в которых находится изолированный человек, следует убирать каждый день.

Анализ на антитела к covid-19

На какой стадии заболевания, какой из анализов более информативен?

Как проходит КТ легких

‍В каких случаях проводится тест?

ОТ-ПЦР-тесты COVID-19 можно проводить в процессе диагностики инфекции SARS-CoV-2 и при необходимости принятия решения о лечении.

Антитела (серологические) тесты предназначены для определения прошлого воздействия вируса SARS-CoV-2 и наличия антител, даже если у человека не было никаких симптомов. Органы здравоохранения также могут проводить серологические тесты для отслеживания масштабов текущей пандемии.

Следует помнить, что определение антител не является предпочтительным методом распознавания активной инфекции. Антитела появляются не раньше, чем через 1-2 недели после заражения, поэтому их нельзя обнаружить на ранних стадиях заболевания. Их производство может занять одну-две недели после того, как человек заболел, поэтому тесты могут не показать раннюю фазу инфекции.

Безопасность при проведении КТ легких в Медгарде

Передача инфекции

Первые случаи COVID-19 связывали с рынком Хуанань, в связи с этим основным механизмом заражения считалась передача от животного к человеку. Последующие случаи не подтвердили эту теорию. В итоге оказалось, что вирус передается между людьми. Из-за возможности передачи вируса до появления симптомов, лучший способ сдержать эту эпидемию – изоляция.м

Передача, как полагают ученые, происходит через респираторные капли (частицы> 5-10 мкм в диаметре), например, при чихании. Передача аэрозоля также возможна в случае длительного нахождения повышенных концентраций аэрозоля в закрытых помещениях. Анализ данных по SARS-CoV-2 в Китае, указывает на необходимость для заражения тесного контакта.

Передача инфекции СOVID-19

Следует отметить, что люди с пре- и бессимптомным течением заболевания могут способствовать до 80% случаев передачи COVID-19. Фактически, распространение в основном ограничивается рамками семьи, кругом медработников и др. людей, располагающихся в пределах 1,8 метра.

Что касается продолжительности жизни вируса на предметах, SARS-CoV-2 может находиться:

• на пластике 2-3 дня;
• на нержавеющей стали примерно 3 дня;
• на картоне до 1 суток;
• на меди до 4 часов. 

Более того, загрязнение в отделениях интенсивной терапии (ОИТ) выше, чем в обычных палатах, и SARS-Cov-2 можно найти на полу, компьютерных мышах, в мусорных баках и на поручнях больничной койки, а также в воздухе на расстоянии до 4 метров от пациентов. 

Однако, поскольку до сих пор имеющиеся данные были получены в экспериментальных условиях, их следует интерпретировать с осторожностью, также принимая во внимание, что присутствие вирусной РНК не обязательно указывает на то, что вирус жизнеспособен и потенциально заразен. Основываясь на данных о первых случаях заболевания в Ухане и исследованиях, проведенных Китайским CDC и местными CDC, время инкубации обычно может составлять от 3 до 7 дней (в среднем 5,1 дня, аналогично SARS) и до 2 недель. Наибольший период от инфицирования до появления симптомов составлял 12,5 дня (95% ДИ от 9,2 до 18). 

Наибольший период от инфицирования до появления симптомов составлял 12,5 дня (95% ДИ от 9,2 до 18). 

Основываясь на данных о первых случаях заболевания в Ухане и исследованиях, проведенных Китайским CDC и местными CDC, время инкубации обычно может составлять от 3 до 7 дней (в среднем 5,1 дня, аналогично SARS) и до 2 недель. Наибольший период от инфицирования до появления симптомов составлял 12,5 дня (95% ДИ от 9,2 до 18). 

Эти данные также показали, что эта новая эпидемия удваивается примерно каждые семь дней, в то время как базовое число воспроизводств (R0 – R ноль) составляет 2,2. Другими словами, в среднем каждый пациент передает инфекцию еще 2,2 людям. Следует отметить, что оценки R0 эпидемии SARS-CoV в 2002–2003 гг. давали цифру примерно 3.

Где сделать платный анализ на коронавирус в СПб?

Платное лабораторное тестирование на коронавирус человек без симптомов инфицирования может делать по собственному желанию и без направления от врача.

Где в Петербурге можно платно сдать мазок из носа и/или зева на анализ? Платный анализ на коронавирус в Санкт-Петербурге можно сдавать в медицинских центрах, имеющих лицензии на работу c патогенами III-IV групп и уведомивших о своих возможностях Роспотребнадзор.

Медицинская лаборатория «Express Medical Laboratory» имеет все необходимые лицензии, современное оборудование и обученный персонал для проведения тестирования на коронавирус.

Мы принимаем анализы на коммерческой основе у всех желающих, но не имеющих выраженных симптомов заболевания. Следует отметить, что сдача анализа не может быть проведена анонимно. При оформлении заказа потребуется паспорт или свидетельство о рождении ребёнка. Стоимость сдачи анализа на коронавирус в нашей лаборатории в СПб составляет 1190 рублей.

В соответствии с распоряжением Правительства РФ о соблюдении режима самоизоляции сдача анализов на коронавирус может осуществляться на дому. В предварительно согласованное время курьер из нашей лаборатории доставит до входной двери zip-пакет для взятия клинических образцов и необходимые для заполнения документы. Вы самостоятельно осуществите забор биоматериала из зева, упакуете образец и заполните соответствующие документы. Курьер будет ожидать на безопасном расстоянии для того, чтобы забрать zip-пакет, в котором находится отобранный биоматериал. Затем в максимально короткие сроки он доставит транспортировочный контейнер с пробами в лабораторию для проведения исследования. Обратившись к нам, вы можете быть уверены, что мы соблюдаем все правила хранения и принципы транспортировки образцов.

Оформить заявку на выезд курьера в любой район Санкт-Петербурга можно только по номерам телефонов, указанным на сайте. Стоимость услуг курьера – 1500 рублей. При оформлении заказа для нескольких пациентов, проживающих по одному адресу, каждому потребуется zip-пакет для сбора биоматериала, но услуга курьера оплачивается 1 раз.

Сколько делаются анализы в медицинской лаборатории «Express Medical Laboratory»? Срок выполнения анализа займет до 5 рабочих дней (с того момента, как был взят мазок). Результаты анализов на коронавирус вы получите по электронной почте. Следует отметить, что в соответствии п.3.3 Постановления Главного государственного санитарного врача РФ от 30.03.2020 №9 при получении положительного результата тестирования на COVID-19 каждая лаборатория должна сообщать об этом в территориальные органы Роспотребнадзора.

Этиология

CoV – это вирусы с положительной цепью РНК, имеющие вид короны под электронным микроскопом (коронам – латинский термин, обозначающий корону) из-за присутствия гликопротеинов-шипов на оболочке. 

Подсемейство Orthocoronavirinae семейства Coronaviridae (отряд Nidovirales) подразделяется на четыре рода CoV: 

• альфакоронавирус (alphaCoV);
• бета-коронавирус (betaCoV);
• дельтакоронавирус (deltaCoV);
• гаммакоронавирус (gammaCoV). 

Кроме того, род betaCoV делится на пять подродов или линий. Геномная характеристика показала, что, вероятно, источники генов alphaCoVs и betaCoVs – летучие мыши и грызуны. Напротив, по-видимому, источники генов deltaCoVs и gammaCoVs – птицы.

Члены этого семейства вирусов вызывают респираторные, печеночные, неврологические и кишечные заболевания у животных, например верблюдов, КРС, летучих мышей, кошек. Сегодня идентифицировано семь человеческих CoV (HCoV), способных инфицировать людей. Некоторые из HCoV были идентифицированы в середине 1960-х годов, тогда как другие – в последние годы.

В целом, результаты исследований показывают, что 2% населения – здоровые носители CoV, и что эти вирусы являются причиной примерно от 5% до 10% острых респираторных инфекций.

Общие человеческие CoVs: 

• HCoV-OC43, HCoV-HKU1 (betaCoVs линии A); 
• HCoV-229E, HCoV-NL63 (alphaCoVs).

У иммунокомпетентных людей они могут вызывать простуду и самоограниченные инфекции ВДП. У лиц с ослабленным иммунитетом и пожилых людей могут возникать инфекции НДП.

Другие CoV у людей:

• SARS-CoV;
• SARS-CoV-2;
• MERS-CoV (бетаCoV линии B и C соответственно). 

Они вызывают эпидемии различной клинической степени тяжести с респираторными и экстрареспираторными проявлениями. При SARS-CoV, MERS-CoV, уровень смертности составляет до 10% и 35% соответственно.

SARS-CoV-2 входит в категорию betaCoVs. Вирус варьируется в нескольких вариантах форм – круглой, эллиптической, плеоморфной, и имеет диаметр примерно 60–140 нм. Он чувствителен к ультрафиолету и теплу. Хотя высокая температура снижает репликацию любого вида вируса, в настоящее время температура инактивации SARS-CoV-2 до сих пор не определена. По многим данным, этот вирус можно инактивировать примерно при 27  C. Напротив, он может сопротивляться холоду даже ниже 0  C. 

Эти типы вирусов можно инактивировать липидными растворителями – эфиром (75%), этанолом, хлорсодержащими препаратами, пероксиуксусной кислотой,  хлороформом, исключая хлоргексидин.

С генетической точки зрения, доказано, что геном нового HCoV, выделенного из кластера пациента с атипичной пневмонией после посещения Ухани, имел 89% нуклеотидную идентичность с SARS-подобным CoVZXC21 летучих мышей и 82% с геном SARS-CoV человека. Из-за этого новый вирус получил название SARS-CoV-2. Его геном с одноцепочечной РНК содержит 29891 нуклеотид, кодируя 9860 аминокислот. 

Хотя происхождение SARS-CoV-2 до конца не изучено, геномный анализ предполагает, что SARS-CoV-2, все-таки, произошел от штамма, выявленного у летучих мышей. Геномное сравнение последовательности SARS-CoV2 человека и известных коронавирусов животных действительно показало высокое сходство (96%) между SARS-CoV2 и betaCoV RaTG13 летучих мышей (Rhinolophus affinis).

Какой анализ достовернее

Обнаружение антител в крови – это свидетельство текущего или уже завершенного инфекционного процесса, помогающее выявить стадию развития болезни или ее окончание. В заключении можно увидеть 2 типа антител – lgM и lgG.

Для выявления коронавирусной инфекции делают разные анализы. Какой из них необходим конкретному пациенту, решает врач

lgM представляют собой так называемые «быстрые» антитела, которые выбрасываются в кровоток первыми и сразу же вступают в борьбу с патогеном. Их выявление говорит о недавнем заражении коронавирусом.

Глобулины типа М появляются в крови на 3-7 день после контакта с больным и означают, что человек болен прямо сейчас

При этом неважно, есть типичные симптомы или нет. lgM определяются в организме в течение ограниченного периода, не превышающего 2-х месяцев

За этот срок «быстрые» антитела М постепенно заменяются «медленными» lgG, синтез которых стартует примерно на 3-ей неделе болезни.

Внимание! Присутствие в крови обоих типов антител означает позднюю стадию Covid-19, просто выработка lgM пока не закончилась. Такой результат обычно получают во время выздоровления, когда болезнь идет на спад.. Проще говоря, антитела М иногда обнаруживаются не только в острой стадии развития инфекции, но и при ее затухании

Количество иммуноглобулинов тоже сугубо индивидуальный показатель, хотя есть средние – референсные – значения, которые считаются нормой

Проще говоря, антитела М иногда обнаруживаются не только в острой стадии развития инфекции, но и при ее затухании. Количество иммуноглобулинов тоже сугубо индивидуальный показатель, хотя есть средние – референсные – значения, которые считаются нормой.

Если lgM атакуют вирус, не давая размножаться и отравлять организм токсинами, то lgG отвечают за формирование иммунитета в долгосрочной перспективе.

Донором иммунокомпетентной плазмы становятся при таких значениях:

Особенности профилактики, диагностики и лечения КОВИД-19

Мировые правительства работают над созданием контрмер, чтобы остановить разрушительные последствия. Специалистами было подсчитано, что своевременно введенные строгие ограничения могли спасти 3 млн жизней в 11 европейских странах. 

Медицинские организации координируют информационные потоки и регулярно издают директивы и руководства для максимального смягчения воздействия угрозы. В то же время ученые всего мира работают не покладая рук, благодаря чему информация о механизмах передачи, клиническом спектре болезней, новых диагностических средствах, а также стратегиях профилактики и лечения быстро развивается. 

Но до сих пор остается много неясностей как в отношении взаимодействия вируса с хозяином, так и в отношении развития пандемии, особенно в отношении времени, когда она достигнет своего пика.

Предполагаемый репродуктивный цикл 2019-nCoV

На данный момент терапевтические стратегии по борьбе с этой инфекцией носят только поддерживающий характер. Поэтому лучшее оружие – профилактика снижения передачи инфекции в обществе. Пример – агрессивные меры в Китае, обеспечившие постепенное сокращение случаев инфицирования. 

Из Китая болезнь распространилась на Европу. В Италии, болезнь сначала атаковала географические регионы на севере, а затем и весь полуостров. Политические органы и медики приложили невероятные усилия, чтобы сдержать ударную волну, которая серьезно испытала систему здравоохранения. 

После этого COVID-19 быстро пересек океан, и по состоянию на 20 июня 2020 года в США было зарегистрировано около 2282000 случаев (121000 смертей). Очень пострадала Бразилия, где зарегистрировано более 1000000 случаев и около 50000 смертей. 

Хотя со временем уровень летальности COVID-19 стал ниже, чем при эпидемиях SARS и MERS, зараженность SARS-CoV-2 намного выше, чем у предыдущих вирусов, с гораздо большим общим числом смертей. Было подсчитано, что примерно каждый пятый человек во всем мире подвергается повышенному риску тяжелого заболевания COVID-19 из-за основных заболеваний.

В разгар кризиса ученые решили использовать платформу Statpearls, представляющую собой инструмент, позволяющий делать обновления в режиме реального времени. Таким образом, цель состоит в том, чтобы собрать информацию и научные доказательства, а также предоставить обзор темы, который будет постоянно обновляться.

Когда лучше сдавать

Мазок на коронавирус необходимо сдавать при наличии характерных признаков Covid-19, среди которых отмечаются следующие:

• подъем температуры тела;
• сухой, непродуктивный кашель, иногда с примесью крови;
• ломота в мышцах и суставах;
• утомляемость, снижение работоспособности;
• ухудшение аппетита;
• боль и сдавленность в груди;
• боль в горле, заложенность носа;
• кожные высыпания;
• одышка, затрудненное дыхание;
• потеря обоняния и вкуса.

Приоритетное право на сдачу анализа по полису ОМС имеют граждане:

• больные пневмонией;
• имевшие контакты с лицами, у которых подтвержден Covid-19;
• имеющие признаки ОРВИ после возвращения из регионов с неблагополучной эпидемиологической обстановкой;
• граждане старше 65 лет, у которых отмечаются признаки простуды;
• люди с хроническими патологиями – онкологическими, эндокринными, сердечно-сосудистыми и др.;
• переболевшие Covid-19, которым нужно подтвердить отрицательный статус.

Те, кто не входит в этот перечень, сдают анализы на платной основе в коммерческих медклиниках.

Как это работает?

Сначала вирусную ДНК выделяют из материала, представленного в лабораторию, денатурируют: на этом этапе двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C, чтобы цепи ДНК разошлись. Затем добавляют так называемые праймеры — начальные звенья цепочки, которые необходимы для старта синтеза новой копии, и так называемую полимеразу — тот самый фермент, который и будет заниматься репликацией ДНК.

Схема: как ДНК-полимераза копирует каждую из цепочек ДНК по отдельности. РНК-праймер изображен белым прямоугольником в начале каждой из двух цепей

Как правило, для лабораторной ПЦР используются ДНК-полимеразы из термофильных бактерий, поскольку в течение реакции смесь многократно охлаждают и нагревают. На следующем этапе в смесь из ДНК, полимеразы и праймеров добавляются нуклеотиды — то есть строительный материал для воспроизводства, после чего емкость с нею нагревается до 37°C, и процесс запускается.

На последующей стадии элонгации полимераза начинает синтез на каждой из двух цепочек разделенной ДНК недостающей пары. Происходит это по принципу комплементарности: фермент присоединяет напротив каждого нуклеотида, из которых состоят ДНК, противоположный. По завершении реакции цикл неоднократно повторяется (см. видео ниже).

Общая схема полимераной цепной реакции. Цифрами обозначены ее этапы. 

В случае с вирусами, содержащими не «двойную» ДНК молекулу, а «одинарную» РНК (а это коронавирусы, или, например, ВИЧ), ученым приходится сначала провести обратную транскрипцию РНК с помощью фермента обратной транскриптазы, а уже потом производить амплификацию по той схеме, что была указана выше. Именно так, собственно, поступает и сам вирус, попадая в клетку, перед тем как встроить свою ДНК в человеческую и приступить к синтезу собственных белков, из которых состоит его «тело» (то есть не генетического материала, а самих вирусных частиц, при ПЦР же, наоборот, копируется генетический материал, а не новые частицы вируса).

Ингибиторы обратной транскриптазы — одни из самых распространенных видов лекарств от ВИЧ-инфекции. К ним относятся, например, зидовудин и ламивудин — самые первые препараты АРВТ, разработанные еще в 80-х.

Производится ПЦР на специальных приборах, амплификаторах, или так называемых термоциклерах (Thermal cycler).

Метод петлевой изотермической амплификации, LAMP

Метод петлевой изотермической амплификации, LAMP (от англ.Loop-mediated isothermal amplification) считается упрощенной ПЦР. Производители тест-систем обещают точность метода до 94%.

Во многом метод LAMP схож с ПЦР, за исключением ряда нюансов: праймеров требуется больше, амплификаторов (приборов, периодически изменяющих температуру) не требуется вовсе, как не требуется и электрофореза. РНК вируса также достраивается до ДНК, а дальше копирование идет при постоянной температуре и занимает всего 20-30 минут.

Чтобы увидеть результат, не требуется электрофорез, достаточно просто взглянуть на пробирку. Мутный осадок говорит о том, что в образце обнаружен вирус. Осадок частично состоит из ионов, освобождающихся из «букв»-нуклеотидов во время синтеза ДНК. Если он появляется, значит, ДНК вируса удалось размножить. Многие производители добавляют в свои тест-системы флуоресцентные красители ДНК, чтобы наличие или отсутствие вирусной частицы не вызывало сомнений.

Reuters

Оптимальное время сдачи тестов

Мазок лучше всего делать сразу после контакта с больным или в самом начале заболевания, когда появились первые признаки. В этом случае результаты будут самыми точными.

После выздоровления мазок из носоглотки сдавать нет смысла, так как вирусные частицы покидают организм

Тест на антитела целесообразно делать не раньше чем на 8 сутки болезни. Именно в это время глобулинов становится достаточно для их выявления тест-системами.

Даже спустя неделю после заражения анализ может определить лишь треть заболевших, спустя 2 недели достоверность исследования повышается до 70%, а по прошествии 3-х недель она достигает 90%.

Справка: Антитела типа М пропадают из кровотока после выздоровления. Сколько будут держаться lgG, предсказать невозможно – этот срок может составить как 2-3 месяца, так и несколько лет.